Dans un charmant quartier résidentiel se dresse une bâtisse noire qui abrite Gru, un méchant vilain, entouré d'une myriade de sous-fifres et armé jusqu'aux dents, qui complote le plus gros casse de tous les temps : voler la lune… Gru affectionne toutes sortes de sales joujoux. Il possède une multitude de véhicules de combat aérien et terrestre et un arsenal de rayons immobilisants et rétrécissants avec lesquels il anéantit tous ceux qui osent lui barrer la route… jusqu'au jour où il tombe nez à nez avec trois petites orphelines qui voient en lui quelqu'un de tout à fait différent : un papa. Le plus grand vilain de tous les temps se retrouve confronté à sa plus dure épreuve : trois fillettes prénommées Margo, Edith et Agnès…

Ayant abandonné la super-criminalité et mis de côté ses activités funestes pour se consacrer à la paternité et élever Margo, Édith et Agnès, Gru, et avec lui, le Professeur Néfario et les Minions, doivent se trouver de nouvelles occupations. Alors qu'il commence à peine à s'adapter à sa nouvelle vie tranquille de père de famille, une organisation ultra secrète, menant une lutte acharnée contre le Mal à l'échelle planétaire, vient frapper à sa porte. Soudain, c'est à Gru, et à sa nouvelle coéquipière Lucy, que revient la responsabilité de résoudre une série de méfaits spectaculaires. Après tout, qui mieux que l'ex plus méchant de tous les temps, pourrait attraper celui qui rivalise pour lui voler la place qu'il occupait encore récemment…

Alors que Gru, totalement déprimé par sa mise à pied, tente de trouver une nouvelle voie, un mystérieux individu se présente pour l'informer du décès de son père. Dans la foulée, il lui annonce l'existence d'un frère jumeau prénommé Dru qui a exprimé le désir d'une rencontre…